狗狗布鲁氏菌如何查?
现在还没有针对布鲁菌的检测试剂,但是布鲁菌可以通过PCR方法检测出来! 如果怀疑犬有布鲁杆菌感染的话可以进行布鲁杆菌的监测,监测方法是收集犬的粪便(10g左右),加入2ml 生理盐水搅拌后用研磨器研磨成均匀浆液(注意不要用力过猛导致细菌散落在外界环境中)之后采用倍比稀释法稀释后,取等量稀释度的样品做PCR扩增,阳性即为布氏杆菌感染。
1、布鲁菌的分离鉴定 取1 ml 样品接种到含10%羊血琼脂平板上进行培养,37℃条件培养48h观察生长的菌落情况以及形态特征;挑取疑似布鲁杆菌的单个菌落送北京农博宇生物科技有限公司进行检测(1~2 d可出结果)。
2、布鲁菌PCR检测 (1)材料与仪器 试剂盒、TRIzol试剂、DNAMarker、ExTag HMDNTPs Mixture、Taq酶(宝生物工程大连有限公司)、DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司);紫外分光光度仪(上海优宁维生物科技有限公司)。 (2)实验步骤 ①总RNA提取 根据试剂盒上的操作说明对样品的总RNA进行提取。将所提RNA用酚/氯仿抽提,异丙醇沉淀获得。于-20℃保存待用。
②cDNA合成 根据试剂盒操作说明书使用Oligo(dT)反转录酶以总RNA为模板合成cDNA第一链,反应体系如下: 反应总体积5μl,5×RTBuffer 4μl,Rnase Free dH2O 3μl, Oligo (dT) Primer 1 μl, Total RNA 1 μl, RT Enzyme Mix 0.6μl。37 ℃作用1 h,99 ℃作用5 min终止反应。
③PCR扩增 扩增反应在0.5毫升离心管中进行,包括95 ℃预变性5min; 95 ℃变性30 s,55 ~ 60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环;最后72 ℃延伸10 min。 PCR产物使用1.2 %凝胶电泳分离并照相记录,同时设非特异性引物阴性对照。PCR扩增产物的回收按照DNA纯化回收试剂盒操作说明进行。
④重组质粒的构建和转化 将所得目的片段与PMD-18 T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取单菌落培养后小量提取质粒,验证是否得到插入片段。
⑤重组质粒的测序 将含有插入片段的质粒送往上海生工进行双向测序。 以上是PCR方法的简要介绍过程及注意事项,希望对您有所帮助,如有错误欢迎指正!谢谢!